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Empleo y estandarización de la citología hepática como herramienta clínica para el diagnóstico de lipidosis hépatica en vacas lecheras Destacado

Empleo y estandarización de la citología hepática como herramienta clínica para el diagnóstico de lipidosis hépatica en vacas lecheras

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La lipidosis hepática es un trastorno metabólico que se desarrolla en vacas lecheras de alta producción en el posparto ocasionado por un desajuste energético cuando la captación de los lípidos excede la oxidación y su secreción por el hígado que usualmente es precedida por las altas concentraciones de ácidos grasos que son movilizados desde el tejido adiposo hacia el hígado. Evaluar la función hepática en su forma clínica resulta compleja, ya que hay una gran variedad de signos y son de tipo multifactorial, además de que el hígado no está condicionado a presentar signos específicos. Por tal motivo, se determinó la efectividad de la citología hepática para identificar acumulación lipídica en el hígado de vacas lecheras posparto, considerándola como una alternativa diagnóstica viable, de muy bajo riesgo y económica, brinda buenos resultados diagnósticos aproximativos y permite en algunos casos el diagnóstico definitivo.

Metodología
En la primera parte del trabajo, se comparó el grado de acumulación lipídica en 13 hígados de vacas lecheras utilizando tres técnicas diagnósticas que son: la histología, prueba de flotación con sulfato de cobre y la citología hepática; y como prueba de referencia se determinaron los valores de triacilgliceridos (TAG), se extrajo la grasa hepática y se midieron por cromatografía de gases. Para validar las pruebas se obtuvieron tres diferentes porciones de cada hígado, abarcando los tres lóbulos hepáticos, se clasificaron en cuatro grados distintos de esteatosis (sin acumulación de grasa, degeneración grasa, ligera, moderada y severa). Para verificar los datos obtenidos se normalizaron los valores de TAG con respecto a su valor medio, categorizados con respecto a la observación histológica. Se compararon los valores de TAG y se correlacionaron utilizando pruebas no paramétricas. Además, con los valores de TAG se obtuvo un punto de corte por medio de curva ROC, obteniendo sensibilidades y especificidades de cada prueba, así como la razón de probabilidades para acertar el diagnóstico.

La segunda parte se determinó la inocuidad de la técnica de la citología observando posibles correlaciones con mensurados bioquímicos y hematológicos, en el cual se llevó a cabo en la ciudad de Gómez Palacio en el Estado de Durango, dentro de la Comarca Lagunera. En un establo lechero con aproximadamente 5,000 vacas en producción, se analizaron en forma completamente aleatoria un total de 25 vacas lecheras multíparas, de raza Holstein, en el periodo de posparto. Se obtuvieron muestras citológicas y sanguíneas en cada animal a tres momentos distintos durante los primeros 21 días posparto (al parto, 10 y 21 días posparto).

Además, se registró su condición corporal, su producción lechera y su estado de salud. Para el estudio hematológico se determinó el hematocrito, sólidos totales, fibrinógeno, así como cuenta total y diferencial de leucocitos.

Los mensurados bioquímicos que se determinaron fueron: glutamato deshidrogenasa (GDH), TAG, colesterol y b- hidroxibutirato. Las muestras citológicas se tomaron en los mismos tiempos que las muestras de sangre y se realizaron considerando las recomendaciones de Bohn et al. Para demostrar los resultados, se utilizó estadística descriptiva para analizar los parámetros hematológicos y bioquímicos en cada uno de los tiempos de muestreo.

Resultados
Se obtuvieron 39 muestras hepáticas de 13 diferentes vacas lecheras. A la observación histológica 12 muestras hepáticas no presentaban aparente acumulación de grasa, 13 muestras se clasificaron con degeneración grasa, ocho con lipidosis ligera, tres como lipidosis moderada y tres con lipidosis severa. Para verificar la acumulación de grasa se examinaron todos los cortes histológicos con la tinción de Ácido Peryódico de Shiff (PAS), y en ningún caso se observó acumulación de glucógeno intracelular. Los resultados observados utilizando la prueba de flotación con sulfato de cobre fue de 21 muestras que presentaban menos del 13% de acumulación grasa, 17 muestras demostraron una acumulación entre 13 y 25% y solamente una muestra presentó entre 34 y 25% de infiltración grasa, no se observaron muestras en estado severo.

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Respecto a los resultados citológicos las características celulares que se observaron en hígados sin infiltración grasa fue de células epiteliales hepáticas de forma redonda o hexagonal con presencia de hasta cuatro vacuolas en el citoplasma y un núcleo céntrico; llegando a presentar alguna alteración en un 15% de células. La degeneración celular, caracterizada por tumefacción y con la presencia de hasta 8 vacuolas en el citoplasma celular, se observó desde 15 a 60% de células afectadas. Las muestras que tenían infiltración lipídica ligera presentaban un 60 a 75% de células afectadas, con un promedio de hasta 10 vacuolas y se llegó a observar una ligera deformidad citoplasmática a causa de la vacuolación. Las muestras con infiltración grasa en grado moderado se caracterizaron por mostrar en un 75 a 85% de células afectadas con vacuolas de pequeñas a medianas, con la principal característica de mostrar pocas células con desplazamiento del núcleo a la periferia. Las muestras con infiltración severa mostraron en más del 85% de las células afectadas, vacuolas de gran tamaño y con el notable desplazamiento del núcleo a la periferia en la mayoría de ellas. Finalmente los resultados que se encontraron en las pruebas citológicas fueron 19 muestras hepáticas normales, seis muestras con degeneración celular, ocho muestras con presencia ligera de lípidos, tres muestras con lipidosis moderada y tres muestras con lipidosis severa.

Los resultados obtenidos de TAG fueron normalizados con respecto a las muestras que no mostraban infiltración grasa.

Las medias y desviaciones estándar para los diferentes grados de infiltración fueron de 10.21 ±7.48 mg/g, 16.07 ±11.03 mg/g, 39.63 ±18.96 mg/g, 135.70 ±43.13 mg/g, 247.59 ±57.04 mg/g respectivamente

Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los grupos por grado de infiltración, resultando significativa (P < 0.001). Posteriormente se efectuó la prueba de Mann-Whitney para identificar la diferencia exacta entre los grupos, cuyos resultados con respecto a su mediana se muestran.

Además se realizó la prueba de Kruskal-Wallis con las cantidades de TAG con respecto a cada lóbulo hepático, obteniendo una P = 0.992, indicando que no existe suficiente evidencia estadística para decir que hay diferencias entre los lóbulos, es decir la acumulación de TAG va afectando en el mismo grado a los tres lóbulos hepáticos.

La prueba de flotación con sulfato de cobre representó la técnica con menor correlación entre las demás técnicas realizadas. Con relación a la histología y citología representó una correlación de r = 0.524, P = 0.001 y r = 0.409, P < 0.012 respectivamente; teniendo una correlación con la cantidad de TAG acumulados de r = 0.557, P < 0.001.

La histología por su parte mostró una buena correlación con respecto a la acumulación de TAG en el tejido hepático (r = 0.828; P < 0.001). Finalmente la citología tuvo una buena correlación con respecto a la acumulación de TAG en el hígado (r = 0.820; P < 0.001) y una excelente correlación con respecto al diagnóstico histopatológico (r = 0.916; P < 0.001).

Se determinaron la sensibilidad y especificidad de la histología con respecto a las diferentes concentraciones de TAG acumulados. Con estos valores se realizó una curva ROC y con una significancia de P < 0.001 se determinó que a partir de 17.25 mg/g de TAG el animal empieza a presentar infiltración de grasa en forma ligera. Con base en este punto de corte se obtuvieron las sensibilidades y especificidades de la prueba de flotación y citología.

Se demostró que los animales identificados con infiltración grasa de ligera a severa por medio de citología hepática, tenían 61.75 veces mayor probabilidad de presentar una acumulación de TAG mayor a 17.25 mg/g en el hígado (P < 0.05), que como ya se describió, es indicativo de lipidosis hepática en vacas lecheras.

En el experimento 2, se obtuvieron las muestras de sangre correspondientes en cada periodo para realizar los hemogramas y perfiles bioquímicos. Se les realizó el aspirado con aguja delgada y se obtuvieron muestras citológicas del hígado; sin embargo, en algunos animales no se pudo obtener material celular suficiente para hacer una adecuada evaluación del grado de infiltración de grasa. El total de muestras en las que se obtuvo material celular fueron 15 de 25 muestras al momento del parto, 22 de 25 a los 10 días posparto y 21 de 25 a los 21 días posparto.

En los estudios hematológicos, se obtuvieron un total de 69 muestras sanguíneas, de las cuales 23 fueron en el periodo de parto, 23 muestras a los 10 días después de parto y finalmente 23 muestras a los 21 días después de parto.

Los resultados bioquímicos obtenidos en los animales muestreados se obtuvieron un total de 70 muestras sanguíneas, de los cuales 23 fueron en el periodo de parto, 23 muestras a los 10 días después de parto y finalmente 24 muestras a los 21 días después de parto. Todos los resultados fueron promediados y clasificados de acuerdo al grado de severidad citológica.

Los cuadros siguientes muestran en un periodo los resultados hematológicos obtenidos a los 21 días después del parto.

Discusión y conclusión
La medición de TAG en el tejido hepático por medio de cromatografía de gases en vacas lecheras aún no ha sido reportada en medicina veterinaria. Carr et al., compararon la cantidad de lípidos en hígados de monos por análisis enzimáticos y cromatografía y en ambos resultaron muy similares. Gaal et al., (citado por Jorristsma et al.), compararon la cantidad de TAG por otros métodos analíticos y por histología. Mencionaron que en una acumulación baja de lípidos corresponden de 0 a 50 mg/g, en acumulación moderada corresponde de 50 a 100 mg/g y una acumulación severa es mayor de 100 mg/g. En este trabajo, la concentración de TAG que se obtuvieron en vacas sanas por cromatografía de gases fue de 10.21 ±7.48 mg/g.

Los resultados promedio que se obtuvieron en esta investigación en acumulación ligera, moderada y severa correspondieron a 39.63 mg/g, 135.7 mg/g y 247.69 mg/g respectivamente. Existe concordancia entre ambos estudios con respecto a la acumulación baja y severa, pero muestra diferencia con los reportados de infiltración moderada. Los resultados pudieron ser ligeramente más altos debido a que el método de cuantificación que se utilizó fue por cromatografía de gases, considerada una herramienta con alta sensibilidad y especificidad para detectar este tipo de compuestos (Skoog et al).

Mulon et al., correlacionaron la infiltración de grasa en 27 vacas por medio de flotación con sulfato de cobre e histologías, resultando en una baja correlación (P = 0.057) entre ambas pruebas. Los resultados de este estudio demostraron correlaciones bajas (r = 0.524 y de r = 0.409 respectivamente) con respecto a las histologías y citologías. La correlación que obtuvo con la prueba de flotación con sulfato de cobre y con la cantidad de TAG hepáticos fue de r = 0.557, siendo también baja. Con una sensibilidad y especificidad del 62 y 68% respectivamente, obtenidas en esta investigación, se puede definir que la evaluación de la infiltración de grasa en el hígado utilizando soluciones de sulfato de cobre por medio de flotación, puede indicar con moderada precisión la infiltración de grasa en el hígado.

Actualmente, se ha descrito que la histología es la herramienta más confiable en la actualidad para diagnosticar lipidosis hepática en vacas lecheras (Rosendo et al). De acuerdo a los datos obtenidos en está investigación, la histología y la presencia de TAG en el tejido hepático presentaron una buena correlación (r = 0.828; P < 0.001). La histología tuvo una sensibilidad y especificidad de 92% y 77% respectivamente; reafirmando que es una herramienta confiable para determinar el grado de infiltración de grasa en el tejido hepático.

Las citologías aplicadas en la práctica bovina pueden ayudar a realizar un diagnóstico o guiar durante el tratamiento clínico (Whitney et al).

La citología en el tejido hepático puede ayudar a diagnosticar lipidosis hepática basada en la acumulación de vacuolas de grasa y en el grado de distorsión del núcleo del hepatocito (Bohn et al). Las observaciones citológicas estudiadas en este trabajo dieron como resultado cuatro categorías de infiltración de grasa de acuerdo a las distintas características celulares. Los hígados con infiltración de grasa severa fueron los que presentaban una desviación del núcleo hacia la periferia del citoplasma. En la clasificación moderada se observó poco desplazamiento del núcleo pero con gran presencia de vacuolas en la célula. Mulon et al., describieron parámetros de evaluación citológica en el hígado de vacas lecheras, considerando la numeración y el tamaño de las vacuolas para dar los grados de severidad. En grado ligero y degeneración no se observó desplazamiento del núcleo. Estas características fueron semejantes en los resultados del estudio. Cabe señalar que el número de vacuolas cambiaba dependiendo de la severidad de la infiltración.

Mulon et al., observaron una correlación significativa entre el diagnóstico histológico y el citológico. Mismas observaciones se obtuvieron en el presente estudio donde se obtuvo una correlación r = 0.916 (P < 0.001); pero al igual que dicho autor, tampoco se encontró una buena correlación entre la prueba de flotación con sulfato de cobre y la citología hepática (r = 0.409). Con respecto a la cantidad de TAG medidos por cromatografía, se determinó una correlación de r = 0.820, probando que la citología indica una verdadera infiltración de grasa en el hígado; además, que presentó una buena sensibilidad y especificidad. Definiendo de esta manera que la citología hepática es capaz de detectar al 93% de los animales verdaderamente enfermos y al 83% de los animales que no tengan infiltración de grasa hepática.

Esto confirma en vacas lecheras lo que mencionan Rosciani et al., que la citología hepática no reemplazará siempre la obtención de una porción del tejido hepático, pero es una alternativa diagnóstica viable, de bajo riesgo, económica, brinda buenos resultados diagnósticos y algunos casos el diagnóstico definitivo.

Autores han mencionado que la cantidad de grasa en el tejido hepático aumenta después del parto (Ametaj et al., citado por Burim), indicando que a los 10 días existe un acumulación aproximada de 60 a 125 g de grasa por día, ocupando hasta el 25% del peso total del hígado. De acuerdo al resultado obtenido a la razón de probabilidades, si la vaca llega a acumular una cantidad superior de 17.25 mg/g de TAG en el hígado, tiene 60 veces más probabilidad de manifestar hallazgos citológicos compatibles con un proceso de infiltración grasa. Este resultado demuestra que al observar una infiltración de grasa ligera por medio de citología hepática, correspondería a una acumulación de TAG de al menos 17.25 mg/g en el tejido hepático. Por su parte, Starke et al., mencionó que la porción de los TAG pueden llegar a alcanzar un aproximado del 68% cuando se exceden los 100 mg/g de los lípidos totales en el tejido hepático, lo que indica la acumulación de otras fracciones lipídicas en el hígado.

De esta manera, se demuestra que la citología es capaz de identificar procesos de infiltración lipídica en el hígado de vacas lecheras, sin la necesidad de recurrir a técnicas más complejas o traumáticas como puede ser tomar una biopsia de tejido, obteniendo la misma calidad de interpretación.

Finalmente, la idea de comprobar el uso de la citología hepática en vacas lecheras, es para brindar a los clínicos de campo e investigadores más opciones para identificar la enfermedad, cambiar la metodología diagnóstica, y acelerar el diagnóstico clínico cotidiano. Para que de esta manera el médico veterinario tome mejores y más rápidas decisiones que fortalezcan su trabajo profesional, mejoren el bienestar animal y la producción lechera. GI. 

Autor/es: *Rodríguez F.F.L., Quiroz R.G., Bouda J., Prado F.M.G., Salas G.G., Salmeron S.F. Salgado H.G., Aparicio C.A., Nuñez O.L.

Modificado por última vez enDomingo, 11 Enero 2015 13:46
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