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Bases farmacológicas de las endomorfinas en el control endógeno y su importancia en anestesiología de grandes especies

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A través de investigaciones en bovinos se han identificado efectos farmacológicos, respuestas fisiológicas y conductuales de dos nuevas sustancias peptídicas de naturaleza opioide denominadas endomorfinas. Las endomorfinas son dos péptidos opioides, clasificados como endomorfina–1 (EM1, Tyr–Pro–Trp–Phe–NH2) y endomorfina–2 (EM2, Tyr–Pro–Phe–Phe–NH2), cuyas secuencias peptídicas fueron identificadas en 1997. Estudios farmacocinpeticos demostraron que estos péptidos se unen con alta afinidad de unión al receptor opioide µ en relación con su capacidad de unión a otros subtipos de receptores opioides (kappa [k], delta [d]), previamente identificados en el SNC de mamíferos. Ambos péptidos están compuestos por cuatro aminoácidos y son estructuralmente distintos de las demás sustancias opioides endógenas conocidas y que estos tienen actividad antinociceptiva a nivel central en las vías descendentes y a nivel local en todas las áreas del cuerpo de los pacientes donde se encuentren receptores opiáceos, es decir en todo el organismo como actualmente se sabe, con este conocimiento se tiene aún más el fundamento y justificación para la aplicación de fármacos opiáceos en el control del dolor perioperatorio en los procedimientos quirúrgicos en bovinos en donde actualmente se sabe que cursan con eventos álgicos desde moderados a severos y muy severos por la naturaleza de la intervención y los procesos fisiológicos que se dan en estos pacientes que han sido mal tratados en cuanto al dolor se refiere por desconocimiento y mitos ya totalmente obsoletos para la anestesiología veterinaria actual.

En esta revisión con reporte de caso a través de la experiencia de los autores daremos a conocer las bases fisiológicas y farmacológicas de los opiáceos puros y sintéticos para su uso en anestesiología en bovinos y su relación con los nuevos péptidos endógenos que se han encontrado en esta especie, con el objetivo de dejar atrás viejos conceptos y mitos que han retrasado la anestesiología veterinaria en comparación con la que se practica en otros países. Los estudios relacionados con la función estructura–actividad de estos péptidos han mostrado que, al igual que la mayoría de los péptidos bioactivos endógenos de naturaleza opioide y no opioide, son vulnerables a la escisión peptídica por cortes enzimáticos mediante la exposición a distintas enzimas proteolíticas que pudiesen participar en la degradación endógena de las endomorfinas, y la obtención de diversos productos de degradación. Asimismo, este artículo menciona la amplia distribución neuroanatómica que poseen las endomorfinas en distintas regiones del cerebro bovino y de otras especies, particularmente en aquellas que regulan el procesamiento y la transmisión de la información nociceptiva y que, por tanto, reflejan el papel potencial de estos péptidos en procesos fisiológicos de analgesia, entre muchos otros (memoria). En este contexto, diferentes estudios basados en el empleo de ensayos inmunológicos (radioinmunoensayos y técnicas de inmunohistoquímica que requieren el uso de anticuerpos específicos generados contra las secuencias consenso de las endomorfinas mostraron una amplia distribución de material inmunoreactivo a endomorfina (vg., EM1–LI, EM2–LI) en tejidos neurales de bovino y roedores. Por ejemplo, la EM1–LI mostró una distribución relativamente abundante en una gran mayoría de las regiones del SNC de mamíferos estudiados, particularmente en la región rostral y superior del tallo cerebral, así como en el núcleo accumbens (NAc), la corteza prefrontal y frontal (PFCx), la amígdala (AMG), el tálamo (TH), el hipotálamo (HPT), el estriado (CPu) y fibras nerviosas de la raíz del ganglio dorsal (DRG). En contraste, la expresión de EMZ mostró ser muy abundante en la región de la médula espinal y en la región caudal del tallo cerebral. La distribución de material inmunoreactivo a EM1–2 en el SNC de mamíferos mostró similitudes en cuanto a la distribución neuroanatómica reportada para otros péptidos opioides endógenos, previamente identificados (encefalinas, dinorfinas, endorfinas). Así mismo, estudios paralelos lograron identificar la presencia de EM1–2–LI en órganos periféricos (bazo, timo, células inflamatorias del tipo de macrófagos–monocitos, linfocitos y leucocitos PMN) y en plasma. Más aún, diversos estudios farmacológicos han mostrado que las actividades biológicas y respuestas fisiológicas de las EM1–2 están mediadas a través de la estimulación de los subtipos de receptores opioides µ1 y µ2.

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Estudios de inmunohistoquímica demostraron la colocalización del receptor opioide µ y las EM1–2 en diversas regiones del SNC de mamíferos como humanos, bovinos, equinos, cabras, perros y gatos. Esto ha permitido proponer que las EM1–2 representan una nueva familia de péptidos opioides con funciones neuromoduladoras relevantes en el SNC, las cuales intervienen en la regulación de los procesos biológicos de percepción del dolor; respuestas de estrés; funciones límbicas de placer y recompensa inducidas por incentivos naturales y/o sustancias psicotrópicas; funciones de estado de alerta y vigilia, funciones cognitivas (de aprendizaje y memoria) y actividades de regulación neuroendócrina, y como con los anteriores opiáceos endógenos pueden ser activados famacológicamente para potencializar la analgesia que caracteriza a este extraordinario grupo farmacológico que por motivos de mala información, no ha sido utilizada a fondo en anestesiología de grandes especies; en este caso en bovinos, donde erróneamente se contraindican por razones totalmente obsoletas. (Argueta) Además, diversos estudios celulares han mostrado que ambos péptidos opioides son capaces de inducir la internalización aguda o endocitosis del receptor opioide µ en células somáticas transfectadas con el ADN (ADNc) que codifica este mismo receptor opioide.

Al igual que otros péptidos opioides (encefalinas), diversos estudios mostraron el catabolismo enzimático de estos péptidos amidados mediante la actividad de enzimas proteolíticas (carboxipeptidasa Y, aminopeptidasa M), lo que ha permitido sugerir que estos péptidos opioides son degradados por rutas de degradación enzimática similares que rigen para múltiples péptidos bioactivos moduladores en el SNC de los mamíferos. Al igual que otros péptidos endógenos, ambas endomorfinas mostraron la capacidad de modular la liberación neuronal de neurotransmisores (DA, NA, 5–HT, ACh) y hormonas peptídicas en áreas específicas del cerebro de los mamíferos. Asimismo, ambos péptidos mostraron una capacidad de generar efectos antinociceptivos potentes en forma dosis–dependiente posterior a su administración ICV o IT en animales experimentales, además de generar respuestas de tolerancia cruzada entre ambas endomorfinas y/o entre la EM1 y alcaloides opiáceos del tipo de la morfina.

FISIOLOGÍA OPÍÁCEA EN GRANDES ESPECIES
Los receptores de opióides pertenecen a la superfamilia de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR: G protein coupled receptors) que están caracterizados por una estructura consistente en un dominio N terminal extracelular, siete dominios de transmembrana, y una parte intracelular terminal C. Estos receptores convierten señales extracelulares en una respuesta intracelular a través de la activación de proteínas G intracelulares acopladas que activan cierto número de moléculas intracelulares. Una subfamilia de los receptores de opióides está conformada por receptores mu, delta y kappa (MOR, DOR; KOR; también conocidos como receptores MOP; KOP y DOP), los cuales tienen una amplia distribución en el cerebro y en la médula espinal.

Estos receptores son activados por péptidos endógenos Met- y Leucoencefalinas, betaendorfinas y dinorfinas y por opióides exógenos como la morfina entre otros. El sistema opióide ha sido ampliamente estudiado, primero usando herramientas farmacológicas como la morfina y sus derivados y luego usando agonistas o antagonistas con selectividad MOR, DOR, o KOR. Las acciones de activación de los receptores de opioides por ligandos exógenos o endógenos, modulan la nocicepción, los mecanismos de recompensa generados por consumo de opioides y la respuesta al estrés La estimulación de estos receptores también influencia la función respiratoria, la motilidad intestinal y la fisiología inmune-endocrina. La clonación de receptores de opioides (5-9) y la manipulación genética del sistema opioide (por ejemplo el desarrollo de ratones knockout) ha permitido identificar tareas específicas de los diferentes tipos de receptores. Mientras es claro que la morfina induce analgesia mediada por activación MOR, el rol de DOR en analgesia permanece poco claro, a pesar de los casos de analgesia inducida por ligandos DOR que ha mostrado estar mediada por MOR. Otros tipos de receptores de opioides corresponden a los receptores sigma y épsilon, de menor importancia clínica, aunque estas afirmaciones en cuanto a estos dos últimos receptores son por falta de investigaciones al respecto, de hecho en estudios realizados por los autores en donde activamos estos receptores farmacológicamente dieron resultados positivos en el control del dolor y que fue demostrado con los datos extraídos de la monitorización transanestésica y posoperatoria utilizando escalas validadas para medir la respuesta álgica después del trauma, sin embargo al ser pocos los modelos que utilizamos no podemos afirmar dicha respuesta, en necesario realizar más investigación sobre este tema. (Argueta) Los receptores de opiáceos que se encuentran a nivel pre-sináptico, actúan disminuyendo influjo de calcio y por ende inhiben la liberación de neurotransmisores; los recetores que se localizan post sinápticamente, hiperpolarizando la célula y de esta forma inhiben la transmisión nerviosa. Las áreas donde se ubican estos receptores están estrechamente relacionadas con las vías de transmisión del dolor como el asta dorsal de la médula espinal, la sustancia gris periacueductal o sustancia gelatinosa de Rolando, zonas del tallo como los núcleos vagales y del tracto solitario, así como áreas de la sustancia pretectal y áreas del sistema límbico y formación reticular. Se sabe que los agonistas de los receptores de opióides modulan la transmisión sináptica a través de mecanismos pre y postsinápticos en el sistema nervioso central. Los agonistas de los receptores muy delta inhiben la transmisión sináptica glutaminérgica en el SNC a nivel de neuronas presinápticas en el asta dorsal de la médula espinal, a nivel de la sustancia gelatinosa de rolando que se expresa en el esquema de Rexed y que fundamento de los autores para utilizar el tramadol en anestesiología equina bajo la técnica polimodal analgésica con resultados significativamente positivos (Argueta, Vaughan); y también se reporta su efecto a nivel de el mesencéfalo. Alternativamente, los opioides pueden abrir uno o más canales de potasio a través de la activación de cada receptor mu, delta o kappa y de la hiperpolarización de sus membranas, lo cual genera inhibición de la transmisión excitatoria en el sistema nervioso central incluyendo la medula espinal y las neuronas del núcleo trigeminal de la médula espinal, de gran importancia en odontoanalgesia en donde los autores basan sus estudios de utilización de opiáceos por vía intraconducto en procedimiento endodónticos para inducir analgesia. Estos receptores de opioides en la médula espinal se encuentran principalmente en la lamina II de Rexed antes mencionada, y se han estudiado ampliamente y se ha demostrado también que la sustancia gelatinosa contiene además péptidos opioides endógenos como las encefalinas (Hunt, Merchenthaler, Argueta).

Las neuronas de la sustancia gelatinosa reciben preferencialmente delgadas fibras mielinizadas A delta, y no mielinizadas de tipo C, indicando como estas neuronas participan en la transmisión nociceptiva. De igual manera, los neurotransmisores inhibitorios: glicina, GABA y L- glutamato involucran la transmisión nociceptiva de las neuronas de la sustancia gelatinosa de rolando de la médula espinal. NUEVOS RECEPTORES Recientes estudios han identificado varios genes con nucleótidos de polimorfismos simples en los genes de los receptores de opioides mu 118 (OPRM1), los cuales están ampliamente distribuidos en el sistema nervioso periférico y se asocian a cambios en la secuencia de aminoácidos en el gen, en el cual el nucleótido adenina es sustituido por el nucleótido guanina en el exón 1 en el nucleótido con posición. El resultado es un cambio del aminoácido asparagina por aspartato en el sitio del amino ácido 40. Varios estudios han ubicado el efecto biológico del OPRM1 en el sistema nervioso periférico con respecto a la afinidad de los opioides por los OPRM1, procesos de desensibilización y endocitosis del receptor, vulnerabilidad al abuso de sustancias (opioides y no opioides), respuesta al estrés, bloqueo de receptores, constricción pupilar inducida por opioides y analgesia inducida por opioides.

Por otra parte, las investigaciones actuales sobre regulación autonómica endocrina y de vías de dolor, se han enfocado en el rol de los péptidos orexina A y B en el hipotálamo sobre los sistemas noradrenérgico y catecolaminérgico y en cómo estos péptidos están implicados en condiciones patológicas y fisiológicas como son el control del ciclo sueño-vigilia, del eje hipotálamo-hipófisis-glándulas adrenales y por supuesto el proceso de modulación de dolor. El conociendo de las nuevas funciones de estos neuropéptidos y sus sitios de acción lograrán grandes descubrimientos en el campo de la anestesiología humana y veterinaria. (Argueta). GI. 

Autor/es: *Pendiente.
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Empleo y estandarización de la citología hepática como herramienta clínica para el diagnóstico de lipidosis hépatica en vacas lecheras

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La lipidosis hepática es un trastorno metabólico que se desarrolla en vacas lecheras de alta producción en el posparto ocasionado por un desajuste energético cuando la captación de los lípidos excede la oxidación y su secreción por el hígado que usualmente es precedida por las altas concentraciones de ácidos grasos que son movilizados desde el tejido adiposo hacia el hígado. Evaluar la función hepática en su forma clínica resulta compleja, ya que hay una gran variedad de signos y son de tipo multifactorial, además de que el hígado no está condicionado a presentar signos específicos. Por tal motivo, se determinó la efectividad de la citología hepática para identificar acumulación lipídica en el hígado de vacas lecheras posparto, considerándola como una alternativa diagnóstica viable, de muy bajo riesgo y económica, brinda buenos resultados diagnósticos aproximativos y permite en algunos casos el diagnóstico definitivo.

Metodología
En la primera parte del trabajo, se comparó el grado de acumulación lipídica en 13 hígados de vacas lecheras utilizando tres técnicas diagnósticas que son: la histología, prueba de flotación con sulfato de cobre y la citología hepática; y como prueba de referencia se determinaron los valores de triacilgliceridos (TAG), se extrajo la grasa hepática y se midieron por cromatografía de gases. Para validar las pruebas se obtuvieron tres diferentes porciones de cada hígado, abarcando los tres lóbulos hepáticos, se clasificaron en cuatro grados distintos de esteatosis (sin acumulación de grasa, degeneración grasa, ligera, moderada y severa). Para verificar los datos obtenidos se normalizaron los valores de TAG con respecto a su valor medio, categorizados con respecto a la observación histológica. Se compararon los valores de TAG y se correlacionaron utilizando pruebas no paramétricas. Además, con los valores de TAG se obtuvo un punto de corte por medio de curva ROC, obteniendo sensibilidades y especificidades de cada prueba, así como la razón de probabilidades para acertar el diagnóstico.

La segunda parte se determinó la inocuidad de la técnica de la citología observando posibles correlaciones con mensurados bioquímicos y hematológicos, en el cual se llevó a cabo en la ciudad de Gómez Palacio en el Estado de Durango, dentro de la Comarca Lagunera. En un establo lechero con aproximadamente 5,000 vacas en producción, se analizaron en forma completamente aleatoria un total de 25 vacas lecheras multíparas, de raza Holstein, en el periodo de posparto. Se obtuvieron muestras citológicas y sanguíneas en cada animal a tres momentos distintos durante los primeros 21 días posparto (al parto, 10 y 21 días posparto).

Además, se registró su condición corporal, su producción lechera y su estado de salud. Para el estudio hematológico se determinó el hematocrito, sólidos totales, fibrinógeno, así como cuenta total y diferencial de leucocitos.

Los mensurados bioquímicos que se determinaron fueron: glutamato deshidrogenasa (GDH), TAG, colesterol y b- hidroxibutirato. Las muestras citológicas se tomaron en los mismos tiempos que las muestras de sangre y se realizaron considerando las recomendaciones de Bohn et al. Para demostrar los resultados, se utilizó estadística descriptiva para analizar los parámetros hematológicos y bioquímicos en cada uno de los tiempos de muestreo.

Resultados
Se obtuvieron 39 muestras hepáticas de 13 diferentes vacas lecheras. A la observación histológica 12 muestras hepáticas no presentaban aparente acumulación de grasa, 13 muestras se clasificaron con degeneración grasa, ocho con lipidosis ligera, tres como lipidosis moderada y tres con lipidosis severa. Para verificar la acumulación de grasa se examinaron todos los cortes histológicos con la tinción de Ácido Peryódico de Shiff (PAS), y en ningún caso se observó acumulación de glucógeno intracelular. Los resultados observados utilizando la prueba de flotación con sulfato de cobre fue de 21 muestras que presentaban menos del 13% de acumulación grasa, 17 muestras demostraron una acumulación entre 13 y 25% y solamente una muestra presentó entre 34 y 25% de infiltración grasa, no se observaron muestras en estado severo.

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Respecto a los resultados citológicos las características celulares que se observaron en hígados sin infiltración grasa fue de células epiteliales hepáticas de forma redonda o hexagonal con presencia de hasta cuatro vacuolas en el citoplasma y un núcleo céntrico; llegando a presentar alguna alteración en un 15% de células. La degeneración celular, caracterizada por tumefacción y con la presencia de hasta 8 vacuolas en el citoplasma celular, se observó desde 15 a 60% de células afectadas. Las muestras que tenían infiltración lipídica ligera presentaban un 60 a 75% de células afectadas, con un promedio de hasta 10 vacuolas y se llegó a observar una ligera deformidad citoplasmática a causa de la vacuolación. Las muestras con infiltración grasa en grado moderado se caracterizaron por mostrar en un 75 a 85% de células afectadas con vacuolas de pequeñas a medianas, con la principal característica de mostrar pocas células con desplazamiento del núcleo a la periferia. Las muestras con infiltración severa mostraron en más del 85% de las células afectadas, vacuolas de gran tamaño y con el notable desplazamiento del núcleo a la periferia en la mayoría de ellas. Finalmente los resultados que se encontraron en las pruebas citológicas fueron 19 muestras hepáticas normales, seis muestras con degeneración celular, ocho muestras con presencia ligera de lípidos, tres muestras con lipidosis moderada y tres muestras con lipidosis severa.

Los resultados obtenidos de TAG fueron normalizados con respecto a las muestras que no mostraban infiltración grasa.

Las medias y desviaciones estándar para los diferentes grados de infiltración fueron de 10.21 ±7.48 mg/g, 16.07 ±11.03 mg/g, 39.63 ±18.96 mg/g, 135.70 ±43.13 mg/g, 247.59 ±57.04 mg/g respectivamente

Se realizó la prueba de Kruskal-Wallis para comparar los grupos por grado de infiltración, resultando significativa (P < 0.001). Posteriormente se efectuó la prueba de Mann-Whitney para identificar la diferencia exacta entre los grupos, cuyos resultados con respecto a su mediana se muestran.

Además se realizó la prueba de Kruskal-Wallis con las cantidades de TAG con respecto a cada lóbulo hepático, obteniendo una P = 0.992, indicando que no existe suficiente evidencia estadística para decir que hay diferencias entre los lóbulos, es decir la acumulación de TAG va afectando en el mismo grado a los tres lóbulos hepáticos.

La prueba de flotación con sulfato de cobre representó la técnica con menor correlación entre las demás técnicas realizadas. Con relación a la histología y citología representó una correlación de r = 0.524, P = 0.001 y r = 0.409, P < 0.012 respectivamente; teniendo una correlación con la cantidad de TAG acumulados de r = 0.557, P < 0.001.

La histología por su parte mostró una buena correlación con respecto a la acumulación de TAG en el tejido hepático (r = 0.828; P < 0.001). Finalmente la citología tuvo una buena correlación con respecto a la acumulación de TAG en el hígado (r = 0.820; P < 0.001) y una excelente correlación con respecto al diagnóstico histopatológico (r = 0.916; P < 0.001).

Se determinaron la sensibilidad y especificidad de la histología con respecto a las diferentes concentraciones de TAG acumulados. Con estos valores se realizó una curva ROC y con una significancia de P < 0.001 se determinó que a partir de 17.25 mg/g de TAG el animal empieza a presentar infiltración de grasa en forma ligera. Con base en este punto de corte se obtuvieron las sensibilidades y especificidades de la prueba de flotación y citología.

Se demostró que los animales identificados con infiltración grasa de ligera a severa por medio de citología hepática, tenían 61.75 veces mayor probabilidad de presentar una acumulación de TAG mayor a 17.25 mg/g en el hígado (P < 0.05), que como ya se describió, es indicativo de lipidosis hepática en vacas lecheras.

En el experimento 2, se obtuvieron las muestras de sangre correspondientes en cada periodo para realizar los hemogramas y perfiles bioquímicos. Se les realizó el aspirado con aguja delgada y se obtuvieron muestras citológicas del hígado; sin embargo, en algunos animales no se pudo obtener material celular suficiente para hacer una adecuada evaluación del grado de infiltración de grasa. El total de muestras en las que se obtuvo material celular fueron 15 de 25 muestras al momento del parto, 22 de 25 a los 10 días posparto y 21 de 25 a los 21 días posparto.

En los estudios hematológicos, se obtuvieron un total de 69 muestras sanguíneas, de las cuales 23 fueron en el periodo de parto, 23 muestras a los 10 días después de parto y finalmente 23 muestras a los 21 días después de parto.

Los resultados bioquímicos obtenidos en los animales muestreados se obtuvieron un total de 70 muestras sanguíneas, de los cuales 23 fueron en el periodo de parto, 23 muestras a los 10 días después de parto y finalmente 24 muestras a los 21 días después de parto. Todos los resultados fueron promediados y clasificados de acuerdo al grado de severidad citológica.

Los cuadros siguientes muestran en un periodo los resultados hematológicos obtenidos a los 21 días después del parto.

Discusión y conclusión
La medición de TAG en el tejido hepático por medio de cromatografía de gases en vacas lecheras aún no ha sido reportada en medicina veterinaria. Carr et al., compararon la cantidad de lípidos en hígados de monos por análisis enzimáticos y cromatografía y en ambos resultaron muy similares. Gaal et al., (citado por Jorristsma et al.), compararon la cantidad de TAG por otros métodos analíticos y por histología. Mencionaron que en una acumulación baja de lípidos corresponden de 0 a 50 mg/g, en acumulación moderada corresponde de 50 a 100 mg/g y una acumulación severa es mayor de 100 mg/g. En este trabajo, la concentración de TAG que se obtuvieron en vacas sanas por cromatografía de gases fue de 10.21 ±7.48 mg/g.

Los resultados promedio que se obtuvieron en esta investigación en acumulación ligera, moderada y severa correspondieron a 39.63 mg/g, 135.7 mg/g y 247.69 mg/g respectivamente. Existe concordancia entre ambos estudios con respecto a la acumulación baja y severa, pero muestra diferencia con los reportados de infiltración moderada. Los resultados pudieron ser ligeramente más altos debido a que el método de cuantificación que se utilizó fue por cromatografía de gases, considerada una herramienta con alta sensibilidad y especificidad para detectar este tipo de compuestos (Skoog et al).

Mulon et al., correlacionaron la infiltración de grasa en 27 vacas por medio de flotación con sulfato de cobre e histologías, resultando en una baja correlación (P = 0.057) entre ambas pruebas. Los resultados de este estudio demostraron correlaciones bajas (r = 0.524 y de r = 0.409 respectivamente) con respecto a las histologías y citologías. La correlación que obtuvo con la prueba de flotación con sulfato de cobre y con la cantidad de TAG hepáticos fue de r = 0.557, siendo también baja. Con una sensibilidad y especificidad del 62 y 68% respectivamente, obtenidas en esta investigación, se puede definir que la evaluación de la infiltración de grasa en el hígado utilizando soluciones de sulfato de cobre por medio de flotación, puede indicar con moderada precisión la infiltración de grasa en el hígado.

Actualmente, se ha descrito que la histología es la herramienta más confiable en la actualidad para diagnosticar lipidosis hepática en vacas lecheras (Rosendo et al). De acuerdo a los datos obtenidos en está investigación, la histología y la presencia de TAG en el tejido hepático presentaron una buena correlación (r = 0.828; P < 0.001). La histología tuvo una sensibilidad y especificidad de 92% y 77% respectivamente; reafirmando que es una herramienta confiable para determinar el grado de infiltración de grasa en el tejido hepático.

Las citologías aplicadas en la práctica bovina pueden ayudar a realizar un diagnóstico o guiar durante el tratamiento clínico (Whitney et al).

La citología en el tejido hepático puede ayudar a diagnosticar lipidosis hepática basada en la acumulación de vacuolas de grasa y en el grado de distorsión del núcleo del hepatocito (Bohn et al). Las observaciones citológicas estudiadas en este trabajo dieron como resultado cuatro categorías de infiltración de grasa de acuerdo a las distintas características celulares. Los hígados con infiltración de grasa severa fueron los que presentaban una desviación del núcleo hacia la periferia del citoplasma. En la clasificación moderada se observó poco desplazamiento del núcleo pero con gran presencia de vacuolas en la célula. Mulon et al., describieron parámetros de evaluación citológica en el hígado de vacas lecheras, considerando la numeración y el tamaño de las vacuolas para dar los grados de severidad. En grado ligero y degeneración no se observó desplazamiento del núcleo. Estas características fueron semejantes en los resultados del estudio. Cabe señalar que el número de vacuolas cambiaba dependiendo de la severidad de la infiltración.

Mulon et al., observaron una correlación significativa entre el diagnóstico histológico y el citológico. Mismas observaciones se obtuvieron en el presente estudio donde se obtuvo una correlación r = 0.916 (P < 0.001); pero al igual que dicho autor, tampoco se encontró una buena correlación entre la prueba de flotación con sulfato de cobre y la citología hepática (r = 0.409). Con respecto a la cantidad de TAG medidos por cromatografía, se determinó una correlación de r = 0.820, probando que la citología indica una verdadera infiltración de grasa en el hígado; además, que presentó una buena sensibilidad y especificidad. Definiendo de esta manera que la citología hepática es capaz de detectar al 93% de los animales verdaderamente enfermos y al 83% de los animales que no tengan infiltración de grasa hepática.

Esto confirma en vacas lecheras lo que mencionan Rosciani et al., que la citología hepática no reemplazará siempre la obtención de una porción del tejido hepático, pero es una alternativa diagnóstica viable, de bajo riesgo, económica, brinda buenos resultados diagnósticos y algunos casos el diagnóstico definitivo.

Autores han mencionado que la cantidad de grasa en el tejido hepático aumenta después del parto (Ametaj et al., citado por Burim), indicando que a los 10 días existe un acumulación aproximada de 60 a 125 g de grasa por día, ocupando hasta el 25% del peso total del hígado. De acuerdo al resultado obtenido a la razón de probabilidades, si la vaca llega a acumular una cantidad superior de 17.25 mg/g de TAG en el hígado, tiene 60 veces más probabilidad de manifestar hallazgos citológicos compatibles con un proceso de infiltración grasa. Este resultado demuestra que al observar una infiltración de grasa ligera por medio de citología hepática, correspondería a una acumulación de TAG de al menos 17.25 mg/g en el tejido hepático. Por su parte, Starke et al., mencionó que la porción de los TAG pueden llegar a alcanzar un aproximado del 68% cuando se exceden los 100 mg/g de los lípidos totales en el tejido hepático, lo que indica la acumulación de otras fracciones lipídicas en el hígado.

De esta manera, se demuestra que la citología es capaz de identificar procesos de infiltración lipídica en el hígado de vacas lecheras, sin la necesidad de recurrir a técnicas más complejas o traumáticas como puede ser tomar una biopsia de tejido, obteniendo la misma calidad de interpretación.

Finalmente, la idea de comprobar el uso de la citología hepática en vacas lecheras, es para brindar a los clínicos de campo e investigadores más opciones para identificar la enfermedad, cambiar la metodología diagnóstica, y acelerar el diagnóstico clínico cotidiano. Para que de esta manera el médico veterinario tome mejores y más rápidas decisiones que fortalezcan su trabajo profesional, mejoren el bienestar animal y la producción lechera. GI. 

Autor/es: *Rodríguez F.F.L., Quiroz R.G., Bouda J., Prado F.M.G., Salas G.G., Salmeron S.F. Salgado H.G., Aparicio C.A., Nuñez O.L.

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Manejo clínico del puerperio y fertilidad en la vaca lechera en sistemas intensivos (segunda parte)

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Tratamiento
Existen diversos tratamientos como la remoción manual de la placenta en combinación con la aplicación local de antibióticos (infusiones intrauterinas) y la administración de productos hormonales (oxitócicos y PGF2a). La eficacia de estos tratamientos es discutible. La remoción manual de la placenta es el tratamiento más popular; sin embargo, no es el mejor, ya que ocasiona daños en el endometrio, que van desde ligeras hemorragias a hematomas, aun cuando no haya evidencias externas. Además, la remoción manual disminuye la capacidad fagocitaria de los leucocitos uterinos, lo que resulta en una metritis más severa, mayor retraso de la involución uterina y un bajo desempeño reproductivo. Otro tratamiento consiste en cortar la placenta a nivel de la vulva. Posteriormente cuando la placenta se ha separado de las carúnculas, debido al proceso de descomposición del tejido, una ligera tracción por la vulva es suficiente para retirarla, sin consecuencias. Estas vacas deben vigilarse por si presentan fiebre, y deben integrarse inmediatamente al programa de revisiones posparto, ya que seguramente desarrollarán metritis o endometritis. La administración de antibióticos, tanto en los casos de remoción manual como en aquellos en los que se corta la placenta, depende del estado general de la vaca. Se debe tener siempre en mente que la RP es el principal factor de riesgo de metritis, por lo que las vacas deben ser observadas para detectar oportunamente a aquellas que presenten fiebre. También se debe considerar que los antibióticos inhiben la putrefacción de las membranas fetales, lo que puede retrasar su expulsión. En caso de optar por la administración de antibióticos, se debe elegir la vía parenteral en vez de la intrauterina, ya que esta última provoca irritación del endometrio, lo cual se asocia con baja fertilidad.

Los tratamientos hormonales estimulan la movilidad uterina (oxitocina, estrógenos y PGF2a); sin embargo, no hay evidencias clínicas en las que se demuestre su eficacia; además, la causa menos frecuente de la RP es la incapacidad mecánica del útero para expulsar la placenta.

Prevención
Las estrategias de prevención de esta patología deben estar orientadas a disminuir la influencia de los factores de riesgo de la RP. Así, se debe disminuir la incidencia de abortos mediante programas eficaces de vacunación y bioseguridad; evitar periodos secos muy largos para que las vacas no lleguen obesas al parto; intervenir lo menos posible en los partos, y si se asiste, se debe hacer con estrictas medidas de higiene; ofrecer sales minerales de buena calidad y administrar antioxidantes antes del parto (vitamina E, selenio y beta carotenos.

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Se han evaluado diferentes tratamientos con PGF2a, para prevenir la retención placentaria y reducir el tiempo de involución uterina en vacas con puerperio anormal. Así, se han aplicado de una a dos inyecciones de PGF2a en las primeras horas posparto, pero los resultados han sido variables, lo cual ha creado controversia en la práctica clínica. En un estudio reciente se probó si una inyección de PGF2a en las primeras 12 h posparto y una segunda inyección 48 h después, disminuyen la incidencia de patologías uterinas y favorecen la fertilidad en vacas lecheras. En este trabajo, el porcentaje de vacas que presentaron retención de placenta fue menor (P < 0.05) en el grupo PGF2a que en el grupo testigo. El periodo del parto al primer estro fue menor (P < 0.05) en las vacas del grupo PGF2a; el periodo del parto al primer servicio fue similar (P > 0.05) en ambos grupos; el porcentaje de vacas gestantes al día 90 posparto fue mayor (P < 0.05) en el grupo PGF2a que en el testigo.

Infecciones uterinas
Alrededor de 95 por ciento de las vacas desarrolla una infección uterina durante los primeros días posparto; sin embargo, la mayoría elimina las infecciones mediante sus mecanismos de defensa y solamente de 30 a 50 por ciento de ellas desarrollan metritis o endometritis dentro de las tres primeras semanas. Las bacterias más frecuentes encontradas en procesos inflamatorios en útero son: Trueperella pyogenes (antes: Arcanobacterium pyogenes, Actinomyces pyogenes y Corynebacterium pyogenes), Fusobacterium necrophorum y Escherichia coli. Estas tres bacterias actúan sinérgicamente.

Metritis puerperal
La metritis puerperal es frecuente en las vacas que tuvieron retención placentaria. Esta patología se observa en las primeras tres semanas posparto y se caracteriza por la presencia de secreciones abundantes en el lumen uterino de color rojo o café, acuosas, fétidas y retraso en la involución. Las vacas afectadas muestran signos de enfermedad sistémica (toxemia y fiebre >39.5°C) y disminución de la producción de leche.

Metritis
La metritis es el proceso inflamatorio que involucra las diferentes capas del útero (mucosa, muscular y serosa). Esta afección se presenta en los primeros 21 días posparto y se caracteriza por retraso en la involución uterina y secreciones purulentas, y no hay signos de enfermedad sistémica.

Endometritis clínica
La endometritis se refiere a la inflamación de la mucosa uterina; clínicamente se caracteriza por un retraso de la involución uterina y por la eliminación de exudado purulento o mucopurulento. Puede presentarse en los primeros 21 días posparto o más, sin presentar ninguna afectación en el estado general.

Endometritis subclínica
Se presenta entre los 21 a los 40 días posparto, no hay signos externos y sólo se diagnóstica mediante citologías uterinas. Esta condición afecta entre el 20 y 40% de las vacas. Los factores de riesgo identificados son la retención placentaria y metritis.

Diagnóstico
El diagnóstico se basa en la evaluación uterina mediante la palpación rectal, en la cual se revisa el grado de involución y las características de las secreciones. Además, es necesaria la evaluación clínica general, ya que las vacas con metritis durante los primeros 10 días posparto llegan a presentar fiebre. Otra forma de establecer el diagnóstico es mediante la evaluación de las secreciones uterinas sin la palpación rectal. Se puede hacer mediante la introducción de la mano por vía vaginal, previa limpieza de la región; aunque este método aparentemente puede representar riesgos, la experiencia en campo indica que es un método seguro y rápido. Otra posibilidad es mediante la vaginoscopía, este método permite la observación del cérvix y de las secreciones uterinas. Existe un instrumento (Metricheck) que se introduce por la vagina y tiene en el extremo una campana atraumática que permite la recolección de las secreciones uterinas.

Impacto de las infecciones uterinas en la reproducción y producción
Las infecciones uterinas (metritis y endometritis) alargan el periodo del parto a la concepción; disminuyen el porcentaje de concepción al primer servicio; aumenta el porcentaje de desechos; disminuye la tasa de vacas inseminadas y disminuyen la producción (300 kg menos que las vacas no afectadas). Además, afectan el periodo del parto a la primera ovulación; en las vacas con puerperio anormal los folículos dominantes son de menor diámetro y producen menos estradiol que las vacas sanas. También una menor proporción de los folículos de la primera oleada ovula en comparación con las vacas con puerperio normal. La endometritis subclínica disminuye el porcentaje de concepción en el primer servicio y aumenta los días abiertos. Asimismo, la metritis o endometritis pueden afectar a los oviductos y provocar inflamación, obstrucción y adherencias (este proceso es más frecuente en las vacas que reciben inyecciones de estrógenos).

Tratamientos
Para evitar el efecto negativo de las infecciones uterinas en la eficiencia reproductiva es necesario el diagnóstico y tratamiento oportunos. Existen diferentes tratamientos para la metritis o endometritis, tales como el uso de antibióticos por vía sistémica o intrauterina, infusiones intrauterinas de sustancias antisépticas, y la administración de hormonas.

Antibióticos
Los tratamientos intrauterinos con antibióticos se han utilizado durante muchos años y son una opción, siempre y cuando se consideren ciertos aspectos: que el útero es un medio anaerobio; que hay presencia de exudados y tejidos en descomposición y la existencia de una gran diversidad de bacterias que incluso algunas de ellas llegan a producir enzimas que inactivan a algunos antibióticos. Al ser el útero un medio anaerobio, los antibióticos del grupo de los aminoglicósidos no son activos, puesto que necesitan oxígeno. Por otra parte, la acumulación de exudado purulento y desechos de tejidos en el útero inhiben la actividad de las sulfonamidas. Los nitrofuranos son efectivos contra T pyogenes, sólo cuando se utilizan dosis extraordinariamente altas; las dosis habituales nunca llegan a alcanzar la concentración mínima inhibidora en el endometrio; además, no son activos en presencia de sangre o exudado purulento, son irritantes y se asocian con problemas de fertilidad. La penicilina por vía intrauterina o parenteral es efectiva para curar infecciones entre los días 25 y 30 posparto; es decir, cuando se ha observado una disminución en la diversidad de especies bacterianas (menor probabilidad que alguna bacteria produzca penicilinasa) y predomina T pyogenes, el cual es sensible a este antibiótico. Las formulaciones intrauterinas de cefalosporinas (cefapirina benzatínica) son eficaces en vacas con endometritis entre los días 15 a 20 posparto y no es necesario retirar la leche del mercado. La tetraciclina es el antibiótico más utilizado debido a su amplio espectro y porque mantiene su actividad en las condiciones del útero posparto; no obstante, la probabilidad de resistencia bacteriana es alta debido a su uso continuo durante muchos años, además ocasiona daño en el endometrio y disminuye la fertilidad.

El problema más importante en la terapia antibiótica radica en fijar un criterio de cuáles animales verdaderamente la necesitan. En los casos de metritis puerperal no hay duda, estas vacas necesitan tratamientos con antibióticos por vía sistémica e intrauterina. Sin embargo, en los casos de metritis y endometritis tomar la decisión es difícil, ya que muchas vacas se curan sin ningún tratamiento. En la práctica, antes de administrar antibióticos a las vacas, se deben considerar algunos de los diversos factores: las características de las secreciones uterinas, los días posparto, el inicio de la actividad ovárica, la presencia de fiebre y la condición corporal.

Tratamientos hormonales
En la práctica, es frecuente la administración de estrógenos en casos de metritis, particularmente cuando el útero retiene mucho líquido. Se conoce que los estrógenos en condiciones fisiológicas favorecen la contractibilidad uterina y auxilian en la eliminación de las infecciones; sin embargo, en dosis farmacológicas el efecto es negativo. La administración de estrógenos puede contribuir a que las infecciones asciendan a los oviductos y provoquen salpingitis, adherencias ováricas e infertilidad. La PGF2a juega un papel importante en el parto y durante la involución uterina. En las vacas con puerperio normal, la duración de los niveles elevados de PGF2a está correlacionada negativamente con el tiempo de involución uterina; de esta manera entre más duren los niveles altos de PGF2a el tiempo de la involución uterina es menor. Además, la administración de PGF2a cada 12 horas del día 3 al 10 posparto acorta el periodo de la involución uterina. Por el contrario, en las vacas con puerperio anormal se ha observado una correlación positiva entre las concentraciones de la PGF2a y el tiempo de involución uterina; de esta manera, las vacas con retención placentaria o endometritis tienen niveles más altos de PGF2a. En la práctica, se utiliza un programa basado en la administración sistemática de PGF2a a todas las vacas cada 14 días a partir del día 25 a 30 posparto. La luteólisis ocasionada por la PGF2a ayuda a la eliminación de las infecciones uterinas, ya que acorta el periodo de influencia de la progesterona y promueve una fase estrogénica. Cabe recordar que la progesterona suprime los mecanismos de defensa uterinos mientras que los estrógenos los activan. Aunque el tratamiento repetido con PGF2a puede beneficiar la recuperación del útero durante el puerperio, no disminuye la prevalencia de endometritis subclínica. Cabe señalar que alrededor de 30 por ciento de las vacas desarrolla cuerpos lúteos de vida larga (21 a 50 días) en los primeros ciclos posparto, bajo estas condiciones la inyección de PGF2a, cada 14 días, acorta el ciclo estral y favorece la eliminación de las infecciones uterinas.

Piometra
Esta patología se desarrolla en las vacas que ovulan en los primeros 20 días posparto y concomitantemente padecen una infección uterina. Bajo estas condiciones, la progesterona favorece la proliferación bacteriana y cierra el cérvix, lo que ocasiona acumulación de exudado purulento en el útero. Los cambios ocasionados en el endometrio alteran la secreción de la PGF2a, lo que resulta en persistencia del cuerpo lúteo y anestro. Las vacas con piometra responden muy bien al tratamiento con PGF2a; una segunda inyección de esta hormona, 14 días después, acorta el periodo de recuperación.

Decálogo para el clínico de la reproducción
Las estrategias para reducir la incidencia de las patologías del puerperio y para tratar a las vacas afectadas son diversas y tienen resultados variables. Después de hacer una revisión de ellas, se pueden recomendar 10 prácticas para mitigar el efecto negativo del puerperio anormal en la fertilidad:

* Evitar que las vacas lleguen al parto con una calificación de condición corporal mayor de 3.5

* Administrar antioxidantes antes y después del parto (Beta carotenos o Vitamina E y selenio). Estos reducen la incidencia de RP y favorecen la capacidad del útero para eliminar las infecciones.

* Asistir los partos sólo en casos necesarios. Si se asiste se debe hacer con las medidas de higiene propias de esta práctica médica.

* Administrar una dosis de PGF2a después del parto asistido y repetirla en 48 horas; esta práctica favorece la eliminación de la placenta.

* Si hay RP, no intentar retirarla por vía vaginal. Es recomendable esperar entre 48 y 72 horas para retirarla mediante palpación rectal y tracción ligera. A todas las vacas con RP se les debe medir la temperatura corporal, para identificar oportunamente a aquellas que desarrollen metritis puerperal.

* Establecer una rutina de revisión de las vacas posparto para el diagnóstico oportuno y tratamiento de infecciones uterinas. Se debe regresar a esta rutina, independientemente del tamaño del hato. Recuerden que la inyección de PGF2a cada 14 días no es suficiente para el tratamiento de vacas con infecciones uterinas posparto.

* En vacas con metritis que afecte el estado general, es conveniente administrar antibióticos por vía sistémica durante 3 a 5 días. Las fórmulas de penicilina son eficaces para estos casos. * Reducir el uso de estradiol en vacas con infecciones uterinas.

* Prescindir el uso de la oxitetraciclina por vía intrauterina; hay antibióticos eficaces, inocuos y con cero días de retiro en leche. * Evitar el uso de sustancias irritantes por vía intrauterina (oxitetraciclina o soluciones de iodo). GI. 

Autor/es: Joel Hernández Cerón*

Continuará… 

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